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菌种保藏的方法
点击次数:888 发布时间:2018-02-26

 菌种是主要的生物资源,也是食用菌生产首要的生产资料。一个优良的菌种被选育出来以后,必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变,才不至于降低生产性能,能长期在生产中使用。因此,菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
  
  各种微生物由于遗传特性不同,因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法,首先应能保持原菌种的优良性状长期不变,同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法:
  
  (一)斜面低温保藏法
  
  将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。
  
  此法由于采用低温保藏,大大减缓了微生物的代谢繁殖速度,降低突变频率;同时也减少了培养基的水分蒸发,使其不至于干裂。该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染。
  
  (二)石蜡油封藏法
  
  此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是:150~170℃烘箱内灭菌lh;或121℃高压蒸汽灭菌60~80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
  
  由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1~2年,或更长。这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。
  
  有试验指出,此法用于保藏红曲霉很合适,保藏1~2年后存活率为100%;也有报道显示,某些蕈菌菌丝用石蜡油保藏法,在3~6℃保藏时菌丝易于死亡,而在室温下反而较理想,这是值得注意的。
  
  (三)砂土管保藏法
  
  这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。
  
  其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1~2):1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1~1.5h,间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108~1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中,放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀,而后置于干燥器中抽真空约2~4h,用火焰熔封管口(或用石蜡封口),置于干燥器中,在室温或4℃冰箱内保藏,后者效果更好。
  
  砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件,故保藏期较长、效果较好,且微生物移接方便,经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长,约1~10年。中国科学院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。
  
  (四)麸皮保藏法
  
  麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体,吸附接入的孢子,然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1:(0.8~1.5)拌匀,装量为试管体积2/5,湿热灭菌后经冷却,接入新鲜培养的菌种,适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中,于室温下干燥数日后移入低温下保藏;干燥后也可将试管用火焰熔封,再保藏,则效果更好。
  
  此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌,保藏期在1年以上。因操作简单,经济实惠,工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉,如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等,其保藏期可达数年至数十年。
  
  (五)甘油悬液保藏法
  
  此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中,置于低温下保藏,本法较简便,但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃,保藏期约为0.5~1年,而采用-70℃,保藏期可达10年。
  
  将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合,并使甘油的终浓度在10%~15%,再分装于小离心管中,置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。
  
  (六)冷冻真空干燥保藏法
  
  冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法,简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中,再在低温下快速将含菌样冻结,并减压抽真空,使水升华将样品脱水干燥,形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封,造成无氧真空环境,zui后置于低温下,使微生物处于休眠状态,而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
  
  由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件,因此保藏期长,一般达5~15年,存活率高,变异率低,是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外,其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐,技术要求较高,且需要冻干机等设备。
  
  保藏菌种需用时,可在无菌环境下开启安瓿管,将无菌的培养基注入安瓿管中,固体菌块溶解后,摇匀复水,然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
  
  (七)液氮超低温保藏法
  
  液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂,在液氮超低温(-196℃)下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温,并在降到低温之前,使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来,以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时,把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度,以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃,然后保藏在-150℃~-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快,由于细胞内自由水来不及渗出胞外,形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1~10)℃/min,细胞死亡率低;随着速度加快,死亡率则相应提高。
  
  液氮低温保藏的保护剂,一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等,但zui常用的是甘油(10%~20%)。不同微生物要选择不同的保护剂,再通过试验加以确定保护剂的浓度,原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。
  
  此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上,是目前被公认的zui有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外,该法适用于各种微生物菌种的保藏,甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏,无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备,且液氮消耗较多,操作费用较高。
  
  要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35~40℃温水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。
  
  (八)宿主保藏法
  
  此法适用于专性活细胞寄生微生物(如病毒、立克次氏体等)。它们只能寄生在活的动植物或其他微生物体内,故可针对宿主细胞的特性进行保存。如植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合,冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后,与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液,然后分装于试管中密封,低温保存。
  
  在上述的菌种保藏方法中,以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法zui为简便,砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之;以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法zui为复杂,但其保藏效果zui好。应用时,可根据实际需要选用。
  
  在国际著名的“美国典型培养物收藏中心”(简写ATCC),仅采用两种zui有效的保藏法,即保藏期一般达5~15年的冷冻真空干燥保藏法与保藏期一般达15年以上的液氮超低温保藏法,以达到zui大限度地减少传代次数,避免菌种变异和衰退的目的。我国菌种保藏多采用3种方法,即斜面低温保藏法、液氮超低温保藏法和冷冻真空干燥保藏法。

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