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病毒载体构建稳定细胞株有什么优势?
点击次数:68 发布时间:2018-10-27
  病毒载体构建稳定细胞株有什么优势?
  化学试剂介导的转染方法和电转,整合率低,同时整合位点不稳定,易发生再次丢失的情况,而且整合位点一般都在转录活跃区之外,所以并不是理想的稳定整合工具。另外,整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度,而不是转染时的DNA的量决定,而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多,导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法,造成入核质粒载体量难以控制,这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方比,更倾向于得到串联多拷贝。以上种种因素,导致使用非病毒载体转染方法构建稳定株,成功率低,稳定性差,稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。
  逆转录病毒载体由于整合率高,是非常理想的稳定株构建工具。而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件,理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中,其整合特性和病毒自身整合特性非常相似:偏向于转录活跃区段,且整合后非常稳定,在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。最重要的是整合几率和所有其它化学,物理转染方法比,增加5至6个数量,使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。由于整合几率非常高,所以很容易获得混合稳定株。
  腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大,被认为是不能整合的一类病毒载体,因此相关研究数据较少,不建议用来构建稳定株。非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低,但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19号染色体,所以从安全性和稳定性角度来说,潜力都非常巨大。由于诸多因素,研究人员仍然在对其进行改造中,包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体对应的整合位点序列。
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