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细胞养不好?这些注意事项请收好(三)
点击次数:61 发布时间:2018-11-28

【技术文章】细胞养不好?这些注意事项请收好(三)

 

 

1、购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因?细胞冷冻管解冻后,为何会有细胞数目太少的情形?

 

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳;血清使用错误或血清的品质不佳;解冻过程错误;冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心;悬浮细胞误认为死细胞;培养温度使用错误;细胞置于 –80 ℃ 太久。

 

研究人员在冷冻细胞培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

 

2、收到的冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落的原因?

 

冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,是因热胀冷缩的物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

 

 

3、如何选用特殊细胞系培养基?

 

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之,选 MEM 做粘附细胞培养,RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养shou选 AIM V(12005)培养基(SFM)。

 

4、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

 

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

 

 

5、GlutaMAX-I 是什么?培养细胞如何利用 GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

 

GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定,即使在 121 磅灭菌 20 分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

 

6、什么培养基中可以省去加酚红?培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

 

酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

 

 

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

 

7、为什么目录上说 Hank's 平衡盐溶液 (HBS) 在空气中使用,不需要 CO2 培养箱?HBS 和 Earle's 平衡盐溶液 (EBS) 有什么本质的功能差别?

 

HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在 Eagles (2.2 g/L) 中比在 Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡,以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中,溶液会变碱,Hanks 液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织,需要用 Eagles 液,如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用 Hanks 液就可以了。

 

8、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么?

 

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用 EDTA 清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

 

9、其他注意事项

 

o 当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。

 

o 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

 

o 大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

 

o 在溶解的一周内使用贮存在 4℃ 冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能开始降解,如果在室温下放置超过 30 分钟,就会变得不稳定。

 

o 为了保持 CO2 培养箱水盘清洁,需定期 (至少每两周一次) 用无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。

 

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